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免疫组织化学(IHC)实验在组织芯片上的注意事项及建议

2021-12-17 11:35:58

1) 脱蜡前60℃烤片30分钟-60分钟;

2) 根据每一种抗体的要求,对组织抗原选择合适的修复方式(骨、骨肉瘤及软骨肉瘤修复过程中尽量平放片子进行修复,且动作轻柔,以免物理震荡导致的脱片)

3) 用3%H202-甲醇封闭内源性过氧化物酶,室温10分钟,PBS洗5分钟×3次;

4) 滴加正常非免疫动物血清,室温10分钟;

5) 除去血清,滴加一抗(即用型/浓缩型,选择合适浓度),4℃冰箱过夜;

6) 用0.1%Tween-20 PBS洗5分钟×3次;

7) 滴加二抗(生物素标记的羊抗鼠/兔IgG),室温孵育10分钟;

8) 用0.1%Tween-20 PBS洗5分钟×3次;

9) 滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶,室温孵育10分钟;

10) DABAEC显色时间在显微镜下控制,蒸馏水洗终止显色;

11) 苏木素复染、水洗、分化后充分水洗,常规脱水透明,中性树胶封片。

实验过程中以下几点应明确和注意:

1.试剂盒选择的建议:a、明确所选试剂盒的原理、特点;b、再根据所选组织芯片的类型选用实验方法。

2.保证抗原质量的建议 a、标准的样本固定、处理方式;b、严格烤片温度及时间;c、依据一抗要求,选择合适的修复方式,标准的修复操作过程。

3.消除或减弱非特异性背景的建议:a、脱蜡彻底;b、严格洗涤时间和次数,洗涤除去未结合抗原或抗体,除去非特异性吸附造成的背景染色;c、优化选择合适的一抗稀释度;d、血清蛋白封闭应充分;e、确保孵育盒湿盒平衡,保证实验反应的水平一致性。f、显色时间显微镜下控制。

4.验证操作流程的建议:a、载玻片必须防脱玻片捞片;b、严格烤片温度和时间;严格抗原热修复的液体温度、时间的把控,不能在修复后让温度骤降;c、应轻柔振摇洗涤,避免洗涤力度过猛。

5.实验对照设定不能遗漏:对照设定用来评定实验系统的正确性,设为阳性对照,用已知抗原阳性的切片与检测样本同时实验,阳性对照应呈阳性结果;阴性对照,用不含已知抗原的样本做对照或空白对照,实验结果为阴性,用以排除假阳性结果。


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